荧光RNA技术

RNA 是生物科学和医学领域中一个新兴且发展迅速的研究领域。除了分子生物学中心法则中众所周知的 mRNA、rRNA、tRNA 的功能外,最近的研究还揭示了大量非编码 RNA (ncRNA) 的身份和功能,它们在各种生物过程中发挥着重要作用,正在重塑人们对 RNA 功能的先前认识。在活细胞中,RNA 表现出复杂的动态,包括表达、降解、易位、剪接和各种化学修饰。

RNA 可视化方法,例如荧光原位杂交 (FISH)、酶共价标记需要细胞固定,不适合活细胞成像。具有工程基序的 RNA 可以与荧光蛋白和特定 RNA 结合蛋白 (RBP) 的融合物相结合,例如 MCP、PCP、λN 或 Cas,可用于在单分子水平上对活细胞中的 RNA 进行成像。然而,未结合的 MCP-FP 分子会扩散到整个细胞中并产生高背景荧光。此外,如此重的结合蛋白是否会影响 RNA 的定位、稳定性和行为仍有待确定。

图1.原位RNA荧光标记与检测技术。

历史上,不同颜色的荧光蛋白 (FP) 彻底改变了生命科学研究,它们是蛋白质的遗传编码标签,可实现活细胞中蛋白质的无背景追踪。感兴趣的 RNA 也可以用荧光团结合 RNA 适体进行类似且直接的遗传标记。这些适体称为荧光 RNA (FR),它们也能够轻松、可靠、无背景地对活细胞中的各种 RNA 进行成像。

 

尽管荧光 RNA看起来简单且前景光明,但目前可用的 FR 的实用性有限。目前荧光 RNA的一些染料配体在活细胞中显示出明显的背景荧光和/或不易扩散穿过质膜或 FR。一些荧光 RNA在活细胞中的稳定性和亮度有限,或作为多聚体发挥作用。与荧光蛋白 类似,理想的荧光 RNA应该是单体的、稳定的、明亮的和多色的,这一直很难实现。

Peppers 是一系列单体、高亮度且稳定的 FR,其最大发射范围从青色到红色,是通过独特设计的树突状细胞可渗透染料配体和多轮优化获得的。这些染料表现出良好的膜渗透性、低细胞毒性,并且在溶液或活细胞中荧光很少。与目前可用的 FR 相比,Peppers 显示出细胞荧光强度和荧光开启率提高了一个数量级,亲和力提高了一到两个数量级,Tm 提高了约 20 o C,pH 耐受性扩大,并且可用于活细胞研究的光谱范围很广。Peppers 首次允许在活细胞中对 mRNA 和其他 RNA 物种进行简单而稳定的成像,同时对目标 RNA 的转录、定位和翻译的干扰最小。Peppers 还可用于通过 CRISPR 显示对基因组位点进行成像、实时跟踪蛋白质-RNA 束缚以及通过结构化照明显微镜对 RNA 进行超分辨率成像。由于其高信噪比,Peppers 可用于定量研究活细胞中的 RNA,使用流式细胞术或微孔板读数。这些 Pepper FR 为细胞 RNA 的实时成像提供了理想的工具。

图 2. Pepper 用于活细胞中无背景 RNA 成像和定量分析。( AC ) Pepper 适体和 HBC 配体。(D) 荧光RNA的血小板。(E)使用 Pepper 对活细胞中的RNA 进行无背景成像。( F)对活细胞中的 RNA 及其蛋白质进行多重成像,显示癌细胞中存在异质翻译。

 

Clivias 是一系列小型、单体且稳定的橙色至红色荧光 RNA,其斯托克斯位移高达 108 nm,可实现简单而稳定的 RNA 成像,同时最大程度地减少对目标 RNA 定位和功能的干扰。与 Pepper 荧光 RNA 结合使用时,Clivias 可实现细胞 RNA 和基因组位点的单激发双发射双色成像。Clivias 还可用于通过活细胞和体内的生物发光成像检测 RNA-蛋白质相互作用。我们相信这些大型斯托克斯位移荧光 RNA 将成为追踪和量化各种生物过程中的多种 RNA 的有用工具。

3 . Cliva用于活细胞和活体动物无背景 RNA定位和相互作用研究。(a -c )君子兰及其 NBSI 配体。 (b)使用 Cliva 对 RNA 进行无背景成像。(e) 君子兰和胡椒可同时成像。 ( f )使用 Nanoluc 和君子兰进行 RNA-蛋白质成像的 BRET 检测。可以使用 BRET 成像在活体动物中标记和测量 RNA。

 

我们刚刚发布了一种高亮度绿色荧光 RNA,称为 Okra。Okra 结合并激活荧光团配体 ACE 以发出绿色荧光。Okra 的细胞亮度比目前可用的绿色 FR 高出一个数量级,可以对活细菌和哺乳动物细胞中的信使 RNA 进行稳健成像。由于其高亮度和光稳定性,Okra 可用于跟踪应激颗粒的 mRNA 的时间分辨测量,以及与 Pepper620 结合的 RNA 活细胞双色超分辨率成像,揭示整个颗粒中 RNA 物种的不均匀和不同分布。Okra 的有利特性使其成为研究 RNA 动力学和亚细胞定位的多功能工具。

4 .黄秋葵绿色荧光 RNA。(a)黄秋葵和 ACE 配体。黄秋葵对 ACE 具有高亲和力,其荧光不依赖于 Mg。 (b)使用黄秋葵对 RNA 进行无背景成像,黄秋葵是最亮的绿色 FR。(c)黄秋葵、辣椒和荧光蛋白的多色成像揭示了应激颗粒中蛋白质和 mRNA 的不同定位。

参考文献

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