荧光RNA技术

RNA 是生物科学和医学领域中一个新兴且发展迅速的研究领域。除了分子生物学中心法则中众所周知的 mRNA、rRNA、tRNA 的功能外，最近的研究还揭示了大量非编码 RNA (ncRNA) 的身份和功能，它们在各种生物过程中发挥着重要作用，正在重塑人们对 RNA 功能的先前认识。在活细胞中，RNA 表现出复杂的动态，包括表达、降解、易位、剪接和各种化学修饰。

RNA 可视化方法，例如荧光原位杂交 (FISH)、酶共价标记需要细胞固定，不适合活细胞成像。具有工程基序的 RNA 可以与荧光蛋白和特定 RNA 结合蛋白 (RBP) 的融合物相结合，例如 MCP、PCP、λN 或 Cas，可用于在单分子水平上对活细胞中的 RNA 进行成像。然而，未结合的 MCP-FP 分子会扩散到整个细胞中并产生高背景荧光。此外，如此重的结合蛋白是否会影响 RNA 的定位、稳定性和行为仍有待确定。

图1.原位RNA荧光标记与检测技术。

历史上，不同颜色的荧光蛋白 (FP) 彻底改变了生命科学研究，它们是蛋白质的遗传编码标签，可实现活细胞中蛋白质的无背景追踪。感兴趣的 RNA 也可以用荧光团结合 RNA 适体进行类似且直接的遗传标记。这些适体称为荧光 RNA (FR)，它们也能够轻松、可靠、无背景地对活细胞中的各种 RNA 进行成像。

尽管荧光 RNA看起来简单且前景光明，但目前可用的 FR 的实用性有限。目前荧光 RNA的一些染料配体在活细胞中显示出明显的背景荧光和/或不易扩散穿过质膜或 FR。一些荧光 RNA在活细胞中的稳定性和亮度有限，或作为多聚体发挥作用。与荧光蛋白类似，理想的荧光 RNA应该是单体的、稳定的、明亮的和多色的，这一直很难实现。

Peppers 是一系列单体、高亮度且稳定的 FR，其最大发射范围从青色到红色，是通过独特设计的树突状细胞可渗透染料配体和多轮优化获得的。这些染料表现出良好的膜渗透性、低细胞毒性，并且在溶液或活细胞中荧光很少。与目前可用的 FR 相比，Peppers 显示出细胞荧光强度和荧光开启率提高了一个数量级，亲和力提高了一到两个数量级，Tm 提高了约 20 ^o C，pH 耐受性扩大，并且可用于活细胞研究的光谱范围很广。Peppers 首次允许在活细胞中对 mRNA 和其他 RNA 物种进行简单而稳定的成像，同时对目标 RNA 的转录、定位和翻译的干扰最小。Peppers 还可用于通过 CRISPR 显示对基因组位点进行成像、实时跟踪蛋白质-RNA 束缚以及通过结构化照明显微镜对 RNA 进行超分辨率成像。由于其高信噪比，Peppers 可用于定量研究活细胞中的 RNA，使用流式细胞术或微孔板读数。这些 Pepper FR 为细胞 RNA 的实时成像提供了理想的工具。

图 2. Pepper 用于活细胞中无背景 RNA 成像和定量分析。( AC ) Pepper 适体和 HBC 配体。(D) 荧光RNA的血小板。(E)使用 Pepper 对活细胞中的RNA 进行无背景成像。( F)对活细胞中的 RNA 及其蛋白质进行多重成像，显示癌细胞中存在异质翻译。

Clivias 是一系列小型、单体且稳定的橙色至红色荧光 RNA，其斯托克斯位移高达 108 nm，可实现简单而稳定的 RNA 成像，同时最大程度地减少对目标 RNA 定位和功能的干扰。与 Pepper 荧光 RNA 结合使用时，Clivias 可实现细胞 RNA 和基因组位点的单激发双发射双色成像。Clivias 还可用于通过活细胞和体内的生物发光成像检测 RNA-蛋白质相互作用。我们相信这些大型斯托克斯位移荧光 RNA 将成为追踪和量化各种生物过程中的多种 RNA 的有用工具。

图3 . Cliva用于活细胞和活体动物中无背景 RNA定位和相互作用研究。(a -c )君子兰及其 NBSI 配体。 (b)使用 Cliva 对 RNA 进行无背景成像。(e) 君子兰和胡椒可同时成像。 ( f )使用 Nanoluc 和君子兰进行 RNA-蛋白质成像的 BRET 检测。可以使用 BRET 成像在活体动物中标记和测量 RNA。

我们刚刚发布了一种高亮度绿色荧光 RNA，称为 Okra。Okra 结合并激活荧光团配体 ACE 以发出绿色荧光。Okra 的细胞亮度比目前可用的绿色 FR 高出一个数量级，可以对活细菌和哺乳动物细胞中的信使 RNA 进行稳健成像。由于其高亮度和光稳定性，Okra 可用于跟踪应激颗粒的 mRNA 的时间分辨测量，以及与 Pepper620 结合的 RNA 活细胞双色超分辨率成像，揭示整个颗粒中 RNA 物种的不均匀和不同分布。Okra 的有利特性使其成为研究 RNA 动力学和亚细胞定位的多功能工具。

图4 .黄秋葵绿色荧光 RNA。（a）黄秋葵和 ACE 配体。黄秋葵对 ACE 具有高亲和力，其荧光不依赖于 Mg。 （b）使用黄秋葵对 RNA 进行无背景成像，黄秋葵是最亮的绿色 FR。（c）黄秋葵、辣椒和荧光蛋白的多色成像揭示了应激颗粒中蛋白质和 mRNA 的不同定位。

参考文献

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